Na noite do dia 23 de julho de 1998, a Equipe Bravo do S.T.A.R.S. (Special Tatics and Rescue Service - Serviço de Resgate e Táticas Especiais) é enviada para investigar casos bizarros, a princípio, de canibalismo aos arredores de Raccoon City, especificamente, nas Montanhas Arklay. Durante o transporte, o helicóptero cai por um pane no motor e a equipe Bravo investiga o local do acidente, onde encontram também os destroços de uma viatura. Rebecca Chambers, uma veterana novata, encontra uma ficha criminal de Billy Coen, um ex-tenente que foi condenado a morte e estaria sendo transportado para cumprir sua sentença. Ao caminhar pela floresta, encontra o Ecliptic Express, um trem executivo da multinacional farmacêutica Umbrella para transportar funcionários. O automóvel estaria transportando mais cedo diversos funcionários da corporação para o Centro de Treinamento, que havia sido fechado há 10 anos, depois da morte do co-fundador da empresa, James Marcus.
A novata de 18 anos entra no trem e começa sua investigação. Em um dos vagões, Rebecca procura por sobreviventes, mas ao invés disso encontra apenas zumbis que se levantam e tentam atacar Rebecca. Ela não tem escolha a não ser matá-los. Ela logo vai para outro vagão e enquanto examina um corpo, Billy Coen aparece logo atrás dela apontando uma arma. Rebecca identifica rapidamente o rapaz e até chega a abordá-lo, mas Billy se recusa submeter à prisão. Assim que ele sai, Edward Dewey entra quebrando uma janela do trem, ferido gravemente. Ele diz para Rebecca ter cuidado e diz que a floresta está infestada de zumbis e monstros. Logo em seguida, Cerberus invadem o trem, obrigando Rebecca dar cabo nas criaturas.
Mais a frente, Billy reencontra Rebecca e ele sugere uma parceria para sobreviver ao incidente. Rebecca se recusa por ter lido a ficha criminal de Billy e segue em frente. Ela encontra no segundo andar do trem, um senhor de idade sentado a uma mesa. Quando vai socorrer o senhor, esse acaba sofrendo mutações e vira um monstro formado por sanguessugas. Ele ataca Rebecca, mas ela é salva por Billy que aparece matando o monstro. Ele reforça a ideia de formarem uma dupla e Rebecca, sem outras opções, aceita a proposta.
Após essa reunião, o trem começa a andar forçando a Rebecca e Billy terem de usar os freios para impedir uma terrível colisão no Centro de Treinamento. Com os eforços juntos, eles obtem êxito parando o trem e logo chegam ao antigo estabelecimento de propriedade da Umbrella.
Enquanto Rebecca e Billy investigam o local, a figura de James Marcus aparece nos monitores de segurança que estão sendo supervisionados por William Birkin e Albert Wesker, ambos funcionários da Umbrella e que haviam entrado na empresa como estagiários de Marcus. A mensagem do co-fundador é simples e direta: ele buscava vingança contra a Umbrella devido seu assassinato há 10 anos atrás e que a primeira parte desse ato se tratou de espalhar o T-Vírus no Centro de Treinamento, no Ecliptic Express e na Mansão Spencer, resultando nos casos de "canibalismo" reportados nas Montanhas Arklay.
Rebecca e Billy solucionam diversos quebra-cabeças no Centro de Treinamento da Umbrella até chegarem ao subsolo onde se separam e Rebecca é atacada por Eliminators. Billy corre para socorrer Rebecca e ele consegue salvá-la por muito pouco. É quando a garota questiona Billy em relação a sua ficha criminal que constava que o rapaz tinha assassinado 23 pessoas inocentes numa operação ao meio do continente Africano.
Billy responde dizendo que na missão de ir atrás de uma guerrilha, seus superiores receberam informações erradas e acabaram abrindo fogo em uma vila cheia de pessoas inocentes. Billy foi contra tal decisão e isso resultou em agressões pelo comandante. Ele acabou desmaiando na cena do crime ficou encarregado pelo ocorrido, assim sendo condenado à morte pela justiça americana.
Seguindo o caminho, Rebecca e Billy conseguem acesso a uma capela onde combatem um Morcego Gigante e descem até um laboratório secreto, antes propriedade de Marcus. No mesmo local do laboratório, havia uma estação com um bonde que os levaria para o NEST, um complexo de laboratórios subterrâneos da Umbrella abaixo de Raccoon City. No entanto, Eliminators atacam Billy quando a dupla está prestes a entrar no bonde e, novamente, se separam.
Rebecca desce sozinha até o NEST, é onde encontra Enrico Marini, o capitão da Equipe Bravo do S.T.A.R.S. Ele pede para que Rebecca vá junto com ele, porém a garota afirma que precisa ir atrás de Billy. Após Enrico seguir com sua investigação, Rebecca é surpreendida pelo Proto Tyrant, a primeira tentativa dos experimentos da Umbrella da linha Tyrant. Apesar da ameaça que o monstro representava, Rebecca consegue derrotá-lo e seguir seu caminho.
Rebecca chega a Estação de Tratamento de Água de Raccoon que estava tomada por zumbis. Lá, ela reencontra Billy e junta-se novamente ao parceiro. A dupla segue até uma sala onde se deparam com Marcus, onde o sujetio revela ser na verdade um clone do co-fundador criado pela Sanguessuga Rainha.
Ele conta aos dois que em 1988, Spencer enviou uma equipe liderada por Birkin e Wesker para assassinar Marcus ao meio de seus experimentos com o T-Vírus. Entretanto, suas sanguessugas foram capazes de adentrar em seu cadáver, copiar seu código genético, absorver suas memórias e criar seu clone. O monstro passa por mutações e ataca Rebecca e Billy, mas ambos conseguem dar cabo na criatura.
Rebecca e Billy sobem até o nível do solo novamente, mas são perseguidos pela Sanguessuga Rainha. Eles percebem que a fraqueza do monstro era a luz do sol, decidindo abrir todas as janelas do estabelecimento para deixar a criatura vulnerável. Billy finaliza a Sanguessuga Rainha exposta à luz solar com um tiro de magum e os dois abandonam o local antes das explosões pelo sistema de autodestruição.
Uma vez fora, Rebecca avista de longe a Mansão Spencer, onde seus demais parceiros da Equipe Bravo estavam. A garota agradece e se despede de Billy pegando sua dog tag e prometendo que Billy Coen estaria morto, permitindo que jovem pudesse ter uma segunda chance. Enquanto Billy foge, Rebecca caminha em direção à Mansão Spencer.