A escolta de Leon faz uma parada na região e um dos policiais se separa do grupo. Leon vai investigar a demora do policial Marcos quando ele se depara com uma casa abandonada. Ao adentrar no local, é surpreendido por um aldeão agressivo que tenta lhe matar. Ele logo descobre que esse sujeito havia assassinado Marcos. Fugindo de outros aldeões, ele chega a uma sala onde descobre que Ashley estava de fato naquela região, o que lhe motiva a continuar em frente, investigando o vilarejo.
Não demora muito para os aldeões o cercarem na praça da vila e tentarem matar o agente a qualquer custo. Após uma luta desesperadora, os sinos de uma igreja começam a tocar e curiosamente, os moradores param o ataque e caminham como "zumbis" até o santuário. Assim começa o pesadelo de Resident Evil 4.
Ingrid Hunnigan entra em contato com Leon logo após o ataque, orientando-o pela vila. Quando o agente chega até uma cabana isolada, se depara com um prisioneiro do culto. Ao tentar soltar o rapaz, Leon é atacado pelo chefe Bitores Mendéz, sendo imediatamente infectado pelo parasita Las Plagas. Algum tempo depois, Leon acorda algemado junto com o prisioneiro que se apresenta como Luis Serra. Após conseguirem se livrar das correntes, Luis foge e deixa Leon sozinho.
O agente segue investigando o vilarejo, buscando pistas pelo paradeiro de Ashley. No caminho, criaturas como Del Lago e El Gigante são obstáculos, mas Leon consegue dar cabo em todas até finalmente chegar à Igreja onde encontra a filha do presidente. Os dois saem escondidos da igreja e Hunnigan os orienta para se apressarem e se deslocarem até um ponto de evacuação. A dupla é cercada por uma horda de Ganados no caminho e se abrigam em uma cabana onde está Luis. Depois de sobreviverem ao ataque, Ashley demonstra os sinais da infecção pelo Las Plagas, deixando Leon preocupado não apenas com a garota, mas também consigo mesmo, já que também sofreu com alguns sintomas do parasita como alucinações e desmaios. Luis explica vagamente sobre a infecção do Las Plagas e promete ajudá-los. Enquanto Leon e Ashley seguem em frente, Luis encontra Ada Wong, quem havia negociado com ele uma amostra da Plaga Dominante, referindo-se a essa como "Âmbar".
Pouco tempo depois, Leon e Ashley são surpreendidos por Bitores Mendéz, quem sofre uma mutação e se torna um grande obstáculo para o agente. Em um celeiro, Leon trava uma batalha contra o chefe da vila e consegue eliminar o monstro. Ele e Ashley seguem por um caminho até chegarem em um castelo com fortes traços medievais. A chegada no local não é nem um pouco boa e depois de encontrarem uma forma de adentrar na enorme fortaleza, se deparam com o castelão Ramón Salazar, proclamando a vontade de Osmund Saddler em querer espalhar a fé dos Los Iluminados ao redor do mundo. Por essa razão, eles sequestraram a filha do presidente e a infectaram com a plaga, na intenção de devolvê-la como serva de Saddler.
Leon e Ashley enfrentam hordas de Ganados até chegarem em uma praça do castelo onde a garota perde o controle de seu ego por um minuto e se separa de Leon. Felizmente, não demora muito para o agente reencontrar a jovem que demonstrava pânico com o que acabaria de acontecer. Leon consegue motivá-la a seguir em frente. Novamente reunidos, a dupla soluciona quebra-cabeças no castelo para desvendar novos caminhos, mas são separados novamente em uma armadilha. Com Leon preso dentro de uma jaula gigante, Ashley precisa enfrentar um grupo de Armaduras sozinha. Quando retorna ao Salão Nobre, passa a chave da cela para Leon, mas logo em seguida é pega por um Verdugo de Salazar.
Leon corre atrás da jovem, mas quando a alcança, Salazar já estaria a obrigando a tomar um líquido escuro, sendo uma espécie de ritual. O Verdugo do castelão joga Leon em um poço que o leva diretamente aos esgotos do castelo. Procurando por uma saída dos esgotos, ele logo chega a um laboratório subterrâneo onde precisa enfrentar Verdugo. Após colocar um fim definitivo no monstro, Leon chega até as minas do castelo onde se depara com Luis novamente, que tinha posse de um remédio para retardar a infecção do Las Plagas.
Com Luis, o agente passa por diversos combates contra os Ganados pelas minas, onde ele toma conhecimento que foi ali em que os Los Illuminados resgataram as plagas. Mais tarde, Luis também revela que ele estava trabalhando para o culto, porém seu arrependimento lhe fez desejar ajudar Leon e Ashley e impedir os planos de Saddler.
Assim que Luis e Leon saem de um elevador, Jack Krauser aparece esfaqueando Luis pelas costas. O soldado buscava vingança e justiça contra o governo pelo que aconteceu na Operação Javier em 2002. Leon e Krauser travam uma batalha que é interferida por Luis com uma arma. Krauser abandona o local e Leon tenta socorrer o parceiro. Infelizmente, Luis não resiste ao dano e morre entregando a Leon a chave de seu laboratório, desejando que isso lhe tivesse feito uma pessoa melhor.
Ao retornar a superfície, Leon segue à Torre do Relógio e se depara com Salazar entregando Ashley para Krauser. O castelão tenta atrasar o agente e depois de receber dano, sofre uma série de mutações, transformando-se em uma criatura nova. Uma batalha acontece e Leon consegue por um fim na 'majestade'.
Seguindo Krauser, Leon conta com a ajuda de Ada para chegar à uma ilha remota dos Los Illuminados em um barco. No caminho, ele aproveita para relembrar os acontecimentos em Raccoon City e perguntar à espiã se ela estaria lhe usando novamente, como foi em 1998 para coletar a amostra do G-Vírus. Ficando sem uma resposta específica, Ada abandona Leon ao chegar na ilha e o agente volta à sua operação de resgate.
Quando se reencontra com Ashley novamente, Leon usa o remédio de Luis para atrasar a infecção no organismo da jovem. Reunidos mais uma vez, a dupla enfrenta mais hordas de Ganados, mas são separados quando Osmund Saddler aparece em carne e osso e utiliza de suas habilidades para controlar as plagas de seus corpos. Sozinho novamente, Leon segue seu caminho, levando-o para uma fortaleza onde Jack Krauser o surpreende. Após uma primeira luta, Krauser começa a sofrer mutações em seu braço e transforma-se em um monstro. O ex-soldado tenta matar Leon, mas com muito esforço, o agente vence a batalha e põe um fim definitivo em seu tutor.
Seguindo em frente, Leon recebe a ajuda do piloto Mike, enviado por Hunnigan, para passar por um exército de Ganados. Mas um ataque de Novistadores, controlados por Saddler, acaba fazendo com que o helicóptero de Mike caia. Seguindo até o paradeiro de Ashley, quando Leon a encontra, Saddler utiliza mais uma vez suas habilidades para enfraquecer Leon, controlando a plaga em seu corpo para lhe causar grandes dores. Ada aparece no local e ganha tempo para Leon fugir com Ashley.
O agente leva a jovem em seus braços até o laboratório de Luis, onde conseguem, enfim, retirar as plagas de seus corpos através de um procedimento cirúrgico extremamente doloroso. Mas sem os parasitas no organismo, ficaria mais fácil de por um fim nos Los Illuminados. Ao procurar uma saída da ilha, Leon encontra Ada desacordada. Ao socorrer a espiã, Saddler utiliza seus Novistadores para combater o agente. O sacerdote começa a sofrer mutações e se torna em um monstro gigante, cabendo a Leon e Ada por um fim em seu reinado.
Após matarem Saddler, Leon e Ada seguem caminhos distintos. Enquanto Ada saia da ilha em um helicóptero de sua organização, Leon e Ashley utilizam um jet-ski, cuja chave é dada a ele por Ada, para fugir do local que estava prestes a ser completamente destruído. A missão de Leon estava cumprida.
Já Ada entra em contato com Albert Wesker para informar que ela havia adquirido o Âmbar. Mas ao tomar conhecimento sobre os planos desastrosos do vilão, Ada muda a rota do helicóptero e já não entregaria mais a amostra para Wesker.